中长期保存方法对角膜内皮细胞活性的影响
第26卷 第6期 航空航天医药
孙 喆,周明渡,李 玲
(哈尔滨爱尔眼科医院,黑龙江 哈尔滨 150076)
摘要 目的:探索简易安全中长期保存供体角膜方法,评价保存后角膜内皮细胞活性为临床提供优质角膜材料。方法:建立简易中期保存液,深低温保存法保存大鼠角膜。将60只大鼠眼随即分为3组。分别为湿房保存,中期保存液和深低温保存。采用活性染色对角膜内皮细胞进行评价。判定3种方法保存的角膜内皮细胞的活性状态。结果:使用中期保存液和深低温保存后复温的角膜植片内皮细胞密度和活性率与湿房保存组比较差异无显著性。结论:简易中期保存液和深低温保存后角膜具有较好的内皮细胞活性和临床应用价值。
关键词 保存方法;角膜内皮细胞
中图分类号:R772.2 文献标识码:A 文章编号:1005 - 9334( 2010) 06-0841-02
An Experiment Study on the Effects of Intermediate and Long - term
Cryopreservation Methods on Corneal Endothelium Viability
SUN Zhe, ZHOU Ming - bo, U Ling
( The Aier Ophthofmology, Hospital of Harbin., Harbin 150076, China)
Abstract Objective :To invcstigate simple and safe methods of intermediate and long - term comeal preservation for clinical use and evaluate different preservation methods on comeal endothelium viability. Methods :Simple and easy intermediate and cryopreservation methods were established 60 rat eyeballs were randomly classified into 3 groups in the moist chamber storage, intermediate and long - term preservation. The differencs of the viability of comeal endothelial cells after different preservation methods were compared Results: The vital staining showed that there were no significant among three preservation methods on the endothelial cell density ( cell/mm2) and ESR%. Conclusions: Intermediate and long-term cryopreserved methods is very useful on penetrating ketoplasty.
Key words Preservation methods; Endothelium; Viability
角膜移植手术是治疗角膜病患者脱盲最有效的方法。眼库及角膜保存技术是开展角膜移植的基础和条件。但是目前角膜移植材料来源短缺及各地区材料分布不均匀,临床上不能满足角膜移植患者量多和应付急诊手术的要求,敌对有限移植材料的保存日益受到人们的重视。所以,建立有效的眼库和深入研究角膜保存方法,延长角膜的生命活力,充分利用有限的角膜材料,随时为临床角膜移植提供优质供体材料是一个重要课题。基于短期保存方法对角膜材料保存时间的限制,如果能做到中长期活性材料的保存,将为角膜移植的开展起到关键的作用。因此根据我国现有国情,从我眼库实际情况出发,积极建立简易中期保存和长期保存方法,通过观察比较不同保存方法对角膜内皮细胞活性染色来评价角膜内皮细胞的活性,得到了满意的优质活性角膜供体,为临床应用中长期保存材料行穿透性角膜移植奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 Wister大鼠30只60眼,雌雄各半,体重150~200 g。I组为湿房保存组;Ⅱ组为中期保存液保存组;Ⅲ组为深低温保存组。
1.1.1 湿房保存组 摘取Wister大鼠眼20只后置4℃冰箱保存24 h。
1.1.2 中期保存组配置简易中期保存液,以细胞培养液MEM作为基础液,加入l%低分子右旋糖酐、2.5%硫酸软骨素;用碳酸氢钠调节pH值为7.2~7.4,过滤器过滤除菌;分装。用前加入庆大霉素使之浓度为100~200 ku/L(10µL)“℃冰箱保存(1)。角膜植片的制备:处死后尽早取材,用庆大霉索生理盐水冲洗,在超净台上减取带1.0 mm巩膜环的角膜片,小心取出色素膜组织,注意整个过程勿伤及角膜内皮。将制备好的角膜植片(10片)内皮面向上置于分装好的中期保存液中保存5d。
1.1.3 长期保存组制备冷冻保存液:①号液:20%人血清白蚤白92%;DMS0 5.5%;硫酸软骨索2.5%;②号液:20%人血清白蛋白90%;DMS0 7.5%;硫酸软骨素2.5%。
1.2 方法 将配制好的抗冻剂装入高压灭荫的EP管中,将无菌条件下制备好的角膜植片(20片)内皮面向上置于预冷备用的1号液中,4℃冰箱平衡10 min;再将角膜片放入2号液中,4℃冰箱平衡1O min;将2号液从冰箱中移出,置于微机监控的程序化降温仪( Cryomed Freezer,USA)。所设程序为:设一个装有同样冷却剂的对照瓶,将膜膜标本温度探子插入保护剂中,以测定标本中的温度变化。降温时以角膜保护剂的温度为标准,先从4℃以1℃/min降至-1O℃,稳定2 min;再以2℃/min降至-30℃,稳定5 min;最后以5℃/min降至- 80℃,稳定4 min。此时将角膜容器连同角膜片直接浸泡于液氮中,并做好标记,贮存时间为11~12周。复温具本操作技术:将EP管从液氮中取出,待管内渗存的液氮自然喷蒸后,迅速放入50℃水浴箱中自轻轻飘动,待瓶内冷冻保存液融化,角膜片周围仅存留一层薄冰时,从水浴箱中取出,用无齿镊夹取角膜片外缘的巩膜环,立即移人4℃冰箱预冷的白蛋白中,10 min后可以供实验所用。将穿透性角膜移植剩下的角膜环用2.5 g/L台盼兰溶液滴于内皮面,4~5 min后将染料用生理盐水洗净;再将2 g/L茜素红溶液滴于内皮面,染色4~5 min,将染料洗净放人24.8 g/L的戊二醛中固定1O min(250 g/L戊二醛1O mL和0.2 mol/L磷酸缓冲液90 mL混合后,用NaOH调节pH至7.3,最后置于光学显微镜加目镜测微仪进行内皮细胞计数下检查并照相(2)