3 讨论
为临床角膜移植和实验研究提供角膜内皮活性好,保存时间长的角膜保存方法是人们研究的主要课题之一。中期保存法因其保存效果好,保存时间相对较长,设备相对简便,遂成为美国大部分眼库最常用的角膜保存方法。本试验根据我眼库现有条件配置简易中期保存液,其基本原则是保存角膜基质能维持角貘内皮细胞正常代谢。中期保存液均以细胞培养基作为基础液,为保存的角膜提供营养物质。4℃状态下,内皮细胞的代谢处于明显的低下状态,亦不产生增殖(3),细胞只需要最基本的营养物质;目前我们尚不能生产一种满足细胞全部生理代谢所需物质的基础液。MEM是目前最常用和最基本的细胞培养基,它含有所需的必需氨基酸,谷氨酸胺,葡萄糖和主要维生素等物质,为了简化配置过程我们选用了细胞培养基MEM作为基础液。目前认为硫酸软骨素为抗氧化剂,可以防止细胞膜脂类过氧化反应,以维持细胞膜的稳定(4)。硫酸软骨素除高渗作用外,还具有稳定细胞膜的作用。
深低温长期保存角膜的方法是根据低温生物学原理,在适当条件下,深低温可以完全抑制细胞的能量代谢,使之处于休眠状态长期保存,当用适当的条件复温后,细胞可恢复代谢活动,发挥其生物学功能。深低温长期保存角膜技术可最长时间的延长库存角膜内皮细胞活性,可程度的满足供眼贮存的需要,并为角膜病医生提供按计划和需要进行角膜移植术的条件,是眼库长期保存角膜活性
的理想方法之一。我们应用控制降温速率理想的微机监控程序冷冻系统成功进行了供眼的角膜程序降温,在降温过程中可随意控制和改变降温速率,在降温过程中可直接观察到冷冻保护剂中的温度变化,是研究深低温保存角膜的理想设备,我们在降温过程中观察到的冷冻保护剂由液相向固相转变时释放热曲线,这是缓慢降温、减少冷冻保护剂冰晶彤成和促其玻璃化形成的标志。我们选用的冷冻保护剂是二甲基亚枫,25 g/L的硫酸软骨素加人人血清白蛋白,其中二甲基亚砜能迅速进入组织细胞,硫酸软骨索能增强角膜内皮细胞对后弹力层的黏附性并抑制冰晶的形成(5),白蛋白对组织细胞起营养保护作用,使之在整个过程中组织细胞不受损害。降温采取缓慢降温,缓慢降温可以避免在细胞内产生冰晶,使细胞免受损害。复温则采用快速复温,这样可以减少应细胞内外的小冰晶反复聚合移动而产生的对细胞化学和机械性损伤(6)。
角膜内皮细胞的活性是评价中长期角膜保存效果的最重要标准。研究发现大鼠角膜内皮细胞对冷冻损伤高度敏感,在损伤修复中不能进行有丝分裂,这一点与人角膜相似,故本试验克服其取材小等不便用之作为评价中长期保存方法的优劣,并为下一步试验作为实验基础。结果显示中期保存液保存和深低温冷冻保存的大鼠角膜内皮细胞密度和内皮细胞存活率与湿房保存组在统计学上无明显差异,从而证明了我们选用的中长期方法是合理的,所保存的角膜有临床应用性。
参考文献
1 董晓光,谢立信,张新晨,角膜中期保存液的研制和临床应用[J].中华眼科杂志,2000,36(1):21~23.
2 Resch MD,Schlotzer - Schrehardt U,Hofnuum – Rummelt C. et al Integration patterms of cryopreserved amniotic membranes into the human comea[J].Ophthalmology,2006 ,113 (11):192,7一1935.
3 Georgladis NS, Ziakas NG, Boboridis KG, et al Cryopre-served amniotic membrane transplantation for the manage-menl of symptomatic bullous keratopathy[J].Clinical&experimental ophthalmoIoSy.2008 ,36( 2):130~135.
4 杨玉洁,高晓唯,任兵,角膜保存研究进展[J],国际眼科杂志,2008,8(7):1435~1437.
5 陈婴,盛敏杰,中长期保存的角膜内皮细胞超微结构的变化[J],现代医学,2009,37(3):237~239.
6 Cannals M, Costa - vila J, Potau JM. et al Morphological Study of Cryopreserved Human Endoyhelium[J].Cells Tis-sues Organs,1999,164(1):37—45.